虎乳靈芝活性成分及藥理作用研究進展
2022-08-24朱玥彤高緒卿李一冰安百強段應策劉成偉 世界中醫藥2022年13期 關鍵詞: 菌核 靈芝 提取物 朱玥彤高緒卿李一冰安百強段應策劉成偉,2 (1 東北林業大學生命科學學院,哈爾濱,150040; 2 黑龍江省酶與類酶工程重點實驗室,哈爾濱,150040) 虎乳靈芝[Lignosusrhinoceros/Lignosusrhinocerotis(Cooke)Ryv],是一種多孔二聚體的藥用蘑菇,隸屬於真菌門,擔子菌亞門(Basidiomycotina),層菌綱(Hymenomycetes),多孔菌目(Polyporales),多孔菌科(Polyporaceae),虎乳靈芝屬(Lignosus)[1-2]。其主要分佈在中國南部(海南地區)、印度尼西亞、菲律賓、斯里蘭卡、澳大利亞、泰國、馬來西亞等熱帶地區[3]。虎乳靈芝作為一種中藥材,富含多醣、萜類、脂肪酸、蛋白質等多種生理活性成分[4],具有抗氧化、抗癌、抗增殖、免疫活性等多種藥理作用[5],在臨床上常被用於治療發熱、百日咳、哮喘、癌症和胃潰瘍等多種疾病[2]。因此,虎乳靈芝被認為是最具有開發前景的藥用真菌之一[2]。近年來,由於人類大規模的採摘,導致虎乳靈芝的野生資源枯竭,而且目前的人工栽培技術仍無法滿足大規模的商品化生產。為了更好地開發和利用虎乳靈芝,加速這一珍貴藥用真菌的應用,本文對其生長栽培、營養成分、活性物質、藥理作用及基因組學5個方面的研究進展進行綜述。 1 生長栽培 虎乳靈芝的成熟形態由菌核、菌柄和菌蓋3部分構成。其中,藥用部位菌核表現為不規則的硬質團塊,直徑為1~5 cm,皮層由交織的菌絲構成,含有大量的澱粉粒,上表面產生許多根狀菌,並滲透到菌核中。外表皮粗糙,顏色多呈灰褐色[6]。見圖1。虎乳靈芝的整體形態與虎奶菇類似,但虎奶菇屬於傘菌目側耳屬,且生藥學方面已鑑定了二者有很大的不同[7]。虎乳靈芝菌絲生長的最適溫度為30 ℃,培養基最適pH值為6~7(中性微偏弱酸),最適碳源為葡萄糖,最適氮源為硝酸鉀和酵母粉[8-9]。虎乳靈芝的成熟菌絲體為白色,含有鎖狀聯合的結構形態,由於菌核的形成需要較長的時間,因此虎乳靈芝整體的生長周期較長,從菌絲體到形成菌核至少需要3個月[10]。虎乳靈芝的栽培方式也是多種多樣的,主要有固體栽培和液體培養。其中,固體培養主要是利用農業廢棄物作為基質進行栽培馴化。Jamil等[11]以木屑89%、米糠10%、石膏1%為基質進行覆土栽培,在28~32 ℃的黑暗條件下培養出虎乳靈芝菌核。Abdullah等[12]使用不同比例的鋸木屑,稻稈和油棕櫚空果穗結合廢棄酵母作為基礎培養基進行栽培,並篩選出木屑、稻稈和廢酵母的最優配比為82∶10∶8,此時菌絲生長速度最快,為3.0 mm/d。而將成熟的基質掩埋在土壤中3~4週後則有菌核的形成,菌核鮮重在80~120 g之間。液體培養具有周期短、產量高、質量可控等優點,已被廣泛應用。Lau等[13]以葡萄糖-酵母提取物-麥芽提取物-蛋白腖培養基用於液體發酵,並在靜態條件下在25 ℃下培養或以150 r/min的往復式振盪器放置,15 d後獲得虎乳靈芝菌絲體。但對虎乳靈芝的生長研究依然十分有限,具有藥用價值的菌核生長周期較長,所以目前為止大規模化生產虎乳靈芝仍是一大難題。 圖1 虎乳靈芝的不同形態(子實體與菌核) 2 營養成分 虎乳靈芝中含有豐富的碳水化合物、蛋白質、脂肪、維生素和灰分等多種營養成分[14]。對於碳水化合物的分佈,研究發現虎乳靈芝子實體中碳水化合物比菌核至少高2倍[15]。纖維含量由多到少依次為:菌蓋和菌柄(較高),菌核(明顯較低)。虎乳靈芝的蛋白質水平適中,除色氨酸外,所有必需氨基酸均存在[15]。而且不同發育階段蛋白質含量和氨基酸組成不同,菌蓋顯著高於菌核和菌柄,子實體的蛋白質含量也遠高於菌核,栽培的菌株比野生的菌株含有更多的蛋白質和水溶性物質[5,16]。虎乳靈芝中含有豐富的氨基酸,含量遠高於其他常見蘑菇,具有很大的應用潛力。研究發現虎乳靈芝與其他藥用菌一樣,脂肪含量都很低,其中菌絲體中的脂肪含量高於子實體和菌核。虎乳靈芝含有核黃素(也稱維生素B2)和菸酸(也稱維生素B3)等常見維生素。其中,核黃素在各發育階段均可檢測到,而菸酸僅在虎乳靈芝菌絲和菌蓋中存在,且在菌絲中含量更高[15]。虎乳靈芝不同部位總灰分含量存在差異,灰分含量由高到低的順序為:菌蓋>柄>菌核。另外,虎乳靈芝還含有許多礦物質元素,如鈣、鈉、鉀、鎂等,實驗數據顯示栽培得到的菌核中各項礦物質元素的含量均大於野生型菌核[5,16]。從營養成分上來說,栽培得到的菌核比野生型更好,因此栽培虎乳靈芝值得大面積推廣。 3 活性物質 3.1 多醣多醣是目前蘑菇中研究最廣泛的活性物質。虎乳靈芝多醣主要由(1→3)-β-D-葡聚醣和(1→6)-β-D-葡聚醣共同組成[4]。這2種葡聚醣均具有抗氧化酶活性,促進分泌抗癌因子,刺激脾臟和胸腺細胞增殖等不同功能[17]。Wong等[18]在正常和無胸腺白變種實驗室老鼠BALB/c小鼠中證實了虎乳靈芝提取物中的β-D-葡聚醣對腫瘤有抑製作用,可促進先天免疫細胞的增殖,同時刺激T細胞釋放白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、IL-2、IL-6等抗腫瘤細胞因子。Hu等[19]以環磷酰胺誘導免疫抑制模型,對虎乳靈芝提取的4種多醣進行免疫調節活性的評價,發現虎乳靈芝多醣具有改善免疫器官,促進淋巴細胞增殖,刺激與抗腫瘤有關的主要細胞因子TNF-α和INF-γ的產生等重要作用。Veeraperumal等[20]發現虎乳靈芝中β葡聚醣可通過激活Rho蛋白依賴性途徑加速腸上皮細胞增殖和遷移,可用作治療胃腸黏膜損傷相關疾病(如消化性潰瘍和炎症性腸病)的治療劑。 3.2 活性蛋白虎乳靈芝中的活性蛋白有凝集素、真菌免疫調節蛋白(Fungal Immunomodulatory Proteins,FIPs)、絲氨酸蛋白酶和纖溶活性蛋白等,具有抗氧化、抗腫瘤、免疫增強、抗菌等多種藥理作用。其中,凝集素是虎乳靈芝蛋白質中最豐富的一種糖蛋白,在細胞識別和黏著反應中起重要作用,具有多種藥理作用。凝集素通過誘導IL-2和IFN-γ的基因表達,從而抑制結腸癌細胞和乳腺癌的生長,並且對人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)具有抗性[21]。虎乳靈芝的FIPs是一種具有抗腫瘤活性的生物蛋白,除免疫調節作用外,還可能用於腫瘤輔助免疫治療[22]。目前,從虎乳靈芝菌核提取物中鑑定的Cerato-platanin亞型蛋白(是一組富含半胱氨酸的蛋白質,與某些植物致病真菌的毒力有關),在對捕食者和寄生蟲的防禦中發揮重要作用[23]。 3.3 其他活性物質除了多醣和活性蛋白以外,虎乳靈芝中還含有脂肪酸、黃酮、酚類、甾醇、萜類等多種藥理作用的活性物質。虎乳靈芝中含有豐富的脂肪酸,包括不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸[14]。其中不飽和脂肪酸中含量最多的是亞油酸,其次是棕櫚酸和立體位酸[13]。黃酮類化合物方面,有研究表明栽培虎乳靈芝(136.92±9.06)mg/g比野生型(110.84±5.89)mg/g含量更多,且具有較好的抗氧化效果[11]。Lau等[4]將虎乳靈芝的菌核切成小塊並研磨成細粉,然後用冷水和熱水分別進行提取,發現虎乳靈芝中含有具有抗氧化活性的酚類化合物,並且發現提取效果栽培型要好於野生型。Lau等[13]採用氣相色譜法-質譜法聯用(Gas Chromatograohy-mass Spectrometry,GC-MS)和超高效液相色譜-電噴霧電離-色譜質譜聯用(Ultra High Performance Liquid Chromatography-electron Spray Ionization-gaschromatography-mass Spectrometry,UHPLC-ESI-MS/MS)對虎乳靈芝菌絲體和菌核中小分子化合物進行鑑定,發現了麥角甾醇(Ergosterol),甾醇類Ergosta-4,7,22-trien-3β-ol以及羊毛脂烷型三萜類化合物。Yap等[24]將虎乳靈芝倍半萜合成基因在釀酒酵母中進行異源表達,得到了(+)香榧醇和α杜松醇倍半萜物質,藥理試驗顯示該倍半萜化合物對乳腺癌細胞MCF-7具有不同程度的抑製作用,半數致死濃度(Median Lethal Concentration,IC50)分別為(3.5±0.58)μg/mL和(18.0±3.27)μg/mL。 4 藥理作用 4.1 抗氧化作用Yap等[5]對虎乳靈芝菌核的熱水提取物(Hot Water Extract,HWE)、冷水提取物(Cold Water Extract,CWE)和甲醇提取物(Methanol Extract,ME)中抗氧化劑還原鐵離子和清除自由基的能力進行考察,發現虎乳靈芝菌核的各種提取物均具有較高的2,2-聯氮-雙-3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)清除能力和自由基還原能力,鐵還原抗氧化能力值範圍為0.006~0.016 mmol/(min·g)。DPPH、ABTS、超氧陰離子清除自由基活性範圍為0.52~1.12、0.05~0.20、0.98~11.23 mmol/g Trolox當量。Kittimongkolsuk等[25]研究發現DPPH自由基清除活性百分比ME、CWE、HWE測定中,百分比值分別為(12.08±0.77)%、(5.88±1.13)%和(4.78±1. 21)%。其中,自由基清除能力由強變弱分別為ME、CWE、HWE。Nallathamby等[26]研究顯示了有機試劑提取虎乳靈芝展現抗氧化活性具有重要影響,利用乙酸乙酯提取菌核的部分顯示具有較高的ABTS+(36~86 mg TE/g提取物)(TE為生育酚當量,Tocopherol)清除活性和DPPH(21%~30%)自由基還原活性(61~122 mg TE/g提取物)。以上的研究也證明了有機試劑提取虎乳靈芝得到的抗氧化效果高於熱水提取物。Lau等[13]採用甲醇和水(8∶2)為溶劑分別對虎乳靈芝的菌絲體,培養液以及菌核進行提取,以自由基清除活性、還原性、金屬螯合活性以及對脂質過氧化的抑製作用等7種抗氧化指標作為檢測標準,考察虎乳靈芝不同形態下的抗氧化效果,繼而發現了菌絲和培養液的效果與菌核的效果一樣甚至高於菌核的抗氧化效果,間接說明了虎乳靈芝的菌絲體在抗氧化效果上與菌核有相同功效,具有可替代的作用。Cai等[27]發現超聲處理的虎乳靈芝多醣-硒納米粒子(U-LRP-SeNPs)比未經超聲處理的LRP-SeNPs具有更高的DPPH和ABTS自由基清除能力。其中LRP-SeNPs=1/10對ABTS和DPPH自由基的清除率分別為52.24%和22.09%,而經過超聲處理以後的清除率分別為83.18%和52.31%。 4.2 抗增殖作用和抗腫瘤作用Zaila等[28]通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]測定細胞活力的百分比,發現虎乳靈芝菌核甲醇加壓液體提取物對人結腸癌細胞(Human Colon Cancer Cells,HCT)116具有抗增殖活性,水性加壓液體提取的IC50為600 μg/mL,甲醇加壓液體提取的IC50為1 200 μg/mL。而且對正常人結腸組織細胞CCD-18Co(正常人結腸組織細胞的一種)未顯示出顯著的細胞毒性,同時也說明不同萃取液極大影響了虎乳靈芝的抗增殖活性。Lee等[29]發現虎乳靈芝菌核的CWE在15.6~1 000 μg/mL濃度範圍內對人乳腺癌細胞MCF-7和人肺癌細胞A549均有抑制增殖活性,IC50分別為96.7 μg/mL和466.7 μg/mL,但對人正常乳腺和肺細胞係無明顯的細胞毒性作用,實際起到抗增殖活性的為高分子量部分,碳水化合物(68.7%)和蛋白質(3.6%),IC50為70.0 μg/mL和76.7 μg/mL。Yap等[30]研究發現虎乳靈芝TM02中的絲氨酸蛋白酶對乳腺癌細胞MCF-7表現出較強的選擇性細胞毒性,且發現所有蘑菇中的F5絲氨酸類蛋白酶均具有抗癌作用。Wong等[31]發現虎乳靈芝菌核中提取的多醣可促進激活人CD56+自然殺傷細胞和正常脾臟的巨噬細胞等先天免疫細胞的增殖,同時可以促進輔助性T細胞和人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞的增殖。虎乳靈芝中活性蛋白對腫瘤細胞也有抗增殖和抑製作用。Lau等[4]發現虎乳靈芝菌核CWE的細胞毒性(IC50:37~355 μg/mL)比熱水提取物(IC50>500 μg/mL)強,且對所有實體瘤均有細胞毒性作用,其中,虎乳靈芝對MCF-7、A549、HL-60、K562、THP-1等癌細胞的IC50分別為96.7、466. 4.3 抗菌和抗病毒活性Mohanarji等[32]採用抑菌圈法的方法測定了虎乳靈芝菌核提取液對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌等15種細菌和白色念珠菌、熱帶念珠菌、克魯西念珠菌和總狀念珠菌4種真菌的抑菌活性,發現虎乳靈芝菌核提取液對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌和真菌均具有較強的抑菌活性。Katas等[33]以虎乳靈芝菌核提取物作為還原劑,以殼聚醣(Chitosan,CS)作為穩定劑來合成金納米顆粒(CS-AuNPs),發現金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌屬、銅綠假單胞菌和大腸桿菌在低密度脂蛋白濃度為0.0125 g/mL下,抑制圈分別為(11.4±0.3) mm、(11.1±0.1) mm、(15.4±0.1) mm、(14.7±0.4) mm,說明CS-AuNPs對革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌和大腸桿菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌)均表現出有效的抗菌活性。另外,虎乳靈芝提取物對於傷口中的某些病原菌和真菌均具有抗菌活性,甲醇和水提取物對除化膿性鏈球菌和黏液性鏈球菌外其他病原菌均有最大抑制,且水提物對大部分病原菌的抑菌活性顯著高於甲醇提取物。虎乳靈芝菌核提取物可抑制登革病毒Ⅱ型活性[34],並且還具有抑制HIV的蛋白酶和逆轉錄酶活性的作用,影響其正常生長與增殖[35]。 4.4 抗炎作用Nallathamby等[26]發現虎乳靈芝熱水和乙醇提取物對RAW264.7巨噬細胞均具有抗炎作用,作用機制為虎乳靈芝的亞油酸可以減少提取物中一氧化氮的產生,並下調腦小膠質細胞中神經炎症性誘生型一氧化氮合酶和環氧合酶2基因的表達,其中,乙醇提取物還可增加白細胞介素10的表達,從而實現其抗炎的效果。 4.5 細胞毒性Phan等[36]研究發現虎乳靈芝水提液對小鼠胚胎成纖維細胞系(NIH/3T3),小鼠神經母細胞瘤細胞,正常人乳腺(184B5)和肺(NL20)細胞均沒有細胞毒性;虎乳靈芝菌核的乙醇提取物對正常人結腸(CCD-18Co)、腎臟(HEK-293)、鼻咽(NP69)、口腔(OKF6)、大鼠腎臟(NRK-52E)和Vero細胞株的細胞活力均無影響[28],發現只有CWE對各種癌細胞均有細胞毒性[37]。 4.6 促進消化Gao等[38]通過將虎乳靈芝的不可消化碳水化合物進行體外發酵,以乳果糖為陽性對照,發現其含有豐富的膳食纖維,可促進腸道蠕動,並可促進長雙歧桿菌和短乳桿菌的生長。 4.7 促進神經突的形成Greene和Tischler[39]發現虎乳靈芝菌核的提取物(發揮作用的主要是粗多醣)可以刺激PC-12細胞,從而使PC-12細胞分化為交感神經元,並延伸軸突生長,且虎乳靈芝提取物對PC-12細胞無細胞毒性作用[40]。Farha等[41]研究發現每日口服低劑量虎乳靈芝菌核水提物可促進受損坐骨神經功能恢復,說明虎乳靈芝提取物能夠促進神經損傷後運動和感覺功能的恢復,並且對神經組織無細胞毒性。 4.8 抗肥胖及降血壓作用Lau等[4]和Lee等[42]研究發現低脂、高鉀、高鈉含量的虎乳靈芝對高血壓和心髒病患者的治療有益處,虎乳靈芝中含有的油酸可以降低膽固醇和降低心血管疾病的發病率,它所含有的β-葡聚醣也可以降低膽固醇。 4.9 鬆弛預收縮氣道作用Lee等[42]從虎乳靈芝CWE中獲得的不同分子量組分,高分子量(High Molecular Weight,HMW)和中分子量(Medium Molecular Weight,MMW)在鬆弛預收縮氣道方面表現出更好的功效,此外,HMW組分顯著抑制了卡巴膽醇,5-羥基異丙胺和鈣誘導的氣道收縮,並發現在HMW和MMW級分中含有的多醣-蛋白質複合物或蛋白質有助於支氣管減速效應。Muhamad等[43]發現虎乳靈芝菌核提取液可以顯著抑制小鼠肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細胞和肺淋巴結引流中輔助性T細胞的細胞群數量,並且能夠降低血清免疫球蛋白的Th2細胞因子水平。 5 虎乳靈芝基因組的研究 隨著基因組測序的不斷深入,虎乳靈芝基因組在2014年已經被報導,基因組大小為34.3 Mb,得到假定基因為10 742個[6]。Yap等[6]在虎乳靈芝的基因組測序中發現了2個公認的免疫調節蛋白基因(GME7566和GME10641),編碼富含半胱氨酸的分泌蛋白和凝集素的基因是虎乳靈芝菌核中表達量最高的基因之一,有研究發現虎乳靈芝中唯一的聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)基因是GME5066,它編碼一個非還原性的PKS,該基因通常與芳香族聚酮的生物合成有關[43]。虎乳靈芝基因組中富含豐富的倍半萜生物合成基因[24],其中,GME3634、GME3638和GME9210這3個基因為高表達合成倍半萜的基因。有研究發現,虎乳靈芝的基因組序列中的一個開放閱讀框(GME631_g),可能參與具有抗氧化能力的三萜生物合成[6]。 6 展望 本文對虎乳靈芝的生長栽培、營養成分、活性物質和藥理作用等進行了總結,旨在對虎乳靈芝進一步開發和利用提供參考依據。虎乳靈芝的菌核具有較高的藥用價值,而菌核提取物也具有多種藥理作用,如具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗病毒的重要活性。虎乳靈芝對大多數正常細胞有較弱或沒有細胞毒性作用,對內臟器官也沒有不利影響。虎乳靈芝自身富含對人類代謝有益的核黃素和菸酸,對胃腸道健康有益。該菌核提取物不僅對神經無細胞毒性作用,而且對於神經的生長和神經損傷恢復有極大的促進作用,還可提高人的耐力和警覺性。虎乳靈芝提取物還有具有抗炎的效果,研究發現乙醇提取物比熱水提取物消炎效果更好[6]。 近年來,由於虎乳靈芝供需不平衡,導致其栽培技術更加珍貴。而液體發酵可以針對性地增加次生代謝物的產量等優點,因此,液體發酵有望成為開發虎乳靈芝活性物質的重要方式。隨著基因組中次級代謝相關基因逐步被解析,從虎乳靈芝中挖掘新的活性天然產物越來越受到重視。相信隨著生物合成技術的發展,虎乳靈芝這一物種的廣泛栽培和活性物質的生物合成進一步研究及開發將成為可能。 |
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四月 2023
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